生物丁醇发酵研究进展
发布时间:2018-06-07 09:49

生物丁醇发酵研究进展

生物质作为光合作用合成的有机体的统称,它包括动、植物及微生物,生物质的能量来源于太阳,以生物质为载体的生物质能具有可再生、易降解和低污染等特点[1]。生物燃料作为目前研究最热且最广泛的新能源之一,以生物质作为载体,产生固、液、气等绿色可持续发展的能源[2],与生物乙醇相比,丁醇具有能量密度大、燃烧值高、蒸汽压较低、与汽油配伍性好,能以任意比例和汽油混合[3-4]等多种优良生物特性,这使得丁醇现已成为仅次于燃料乙醇的新一代可再生能源,目前通过生物发酵生产丁醇已逐渐成为全球研究热点。但是生物发酵生产丁醇存在原料成本高、发酵菌种产能低、发酵过程产物抑制、ABE发酵产量偏低等问题,限制了其规模化生产及商业应用[5-9]。基于以上问题及研究现状,本文从生物丁醇的可再生原料,代谢调控和代谢工程角度,评述了生物丁醇发酵研究的最新进展,旨为工程菌的构建和基于过程工程技术的代谢调控提供理论依据。
 
1 生物丁醇发酵原料研究
1861年Pasteur最早采用微生物发酵生产丁醇,1914年Weizmann发现梭状芽孢杆菌(Clostridium acetobutylicum)通过ABE途径生产丁醇[10],该菌可利用葡萄糖、木糖、蔗糖及主要降解产物为糖类的原料生产丁醇。
 
1.1 常用碳源
传统工业上,蔗糖是用于ABE发酵的碳源之一。拜氏梭菌和丙酮丁醇梭菌以蔗糖为原料,通过磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转移酶途径发酵生产丁醇[11],其中蔗糖酶Ⅱ复合物、蔗糖-6-磷酸水解酶和果糖激酶对蔗糖吸收起正调控作用。除了单一碳源发酵,混合糖发酵过程中,所有的糖都会被生产菌种所利用,但利用顺序及速率有差异性。有研究发现,拜氏梭菌BA101糖利用的顺序依次是葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及甘露糖[12]。尽管梭菌能利用纤维素二塘、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和木糖,但是葡萄糖仍是其首选的碳源。郭亭等[13]研究了以葡萄糖、木糖、蔗糖和混合糖等为碳源的P2培养基中丁醇的生产情况发现,不同碳源对丁醇产率有显著的影响,葡萄糖和蔗糖为底物时,丁醇产量可达12-13 g/L;木糖、混合糖为底物时,丁醇产量在10 g/L左右。
 
1.2 淀粉和糖蜜
Virunanon等[14]使用木薯浆和木薯淀粉废水进行丁醇发酵,该淀粉废水经酶解2 h后作为发酵碳源,单独使用木薯浆时,丁醇产率极低,只有0.03 g/L,而得到的乙醇则高达8.98 g/L;单独使用木薯淀粉时,乙醇、丁醇和丙酮产物量分别为1.76、0.85和0.25 g/L,而木薯浆和木薯淀粉混合发酵则能产生丁醇、乙醇、丙酮分别为2.51,1.76和0.6 g/L,此中调控丁醇代谢途径的关键酶还有待进一步研究。糖蜜作为一种由水、总糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)、重金属、悬浮胶体、维生素和含氮化合物组成的工业深色糖浆副产品,它也是用于商业生产丁醇的原料之一[15]。除此之外,甜菜、甘蔗也是工业生产的第一批碳源,淀粉原料因其营养丰富、价格低廉、容易获取,发酵过程中不需要添加其他诱导物等特点,是工业发酵丁醇的首选原料[16]。但是目前利用这些原料生产丁醇的效率仍然偏低,因此,加大对此类原料的预处理和优化发酵条件的研究迫在眉睫。
 
1.3 甘油和藻类
甘油作为生物柴油生产中的副产品,也可作为碳源被梭菌利用生产丁醇[17]。以甘油为唯一碳源进行发酵的第一个溶剂生产菌是巴氏梭菌,甘油通过磷酸化和氧化两种途径,部分转化为可用于糖酵解途径的二羟基丙酮磷酸盐(Dihydroxyacetone phosphate,DHAP)[11]。与其他原料相比,藻类以其增长率高,水需求量少,高效二氧化碳减排等优势,可作为一种ABE生产的环保型潜在原料。但藻类的生物量是在一种极稀的溶液中产生的,此溶液在分离和下游加工时的成本相对较高,这是利用藻类生产丁醇亟待解决的问题之一[18]。
 
1.4 甜高粱
甜高粱作为粒用高粱的一个变种,它的秸秆含糖量较高,出汁率可达60%,其中以蔗糖、葡萄糖、果糖为主,还含有少量其他可溶性糖,是良好的发酵用原料。程意峰等[19]以甜高粱秸秆汁为发酵原料,挑选可以利用甜高粱汁高效生产丁醇的菌种作为试验菌株,通过对发酵条件优化,使丁醇产量从原来的4.415 g/L为提高到10.29 g/L,甜高粱汁无需水解,灭菌冷却后可直接接种发酵,是工业化生产丁醇的优质原料。
 
1.5 木质纤维素
发酵原料的可用性和经济可行性,是当前生物丁醇研究的挑战。高效利用低成本木质纤维素废料作为ABE发酵的碳源,不仅是实现生物丁醇经济生产的优良方法,而且可从根本上解决温室气体排放,缓解全球能源危机[7]。
 
麦麸、玉米秸秆和木质生物材料为目前常用的纤维素原料。Liu等[20]利用麦麸-稀酸水解液作为ABE发酵的原料,使用拜氏梭菌ATCC 55025,经72 h发酵后,总溶剂产量为11.8 g/L,其中丁醇量为8.8 g/L,此研究表明麦麸可作为ABE发酵的潜在可再生资源。针对一些可溶性木素对发酵过程的抑制问题,Liu等[21-22]开展了玉米秸秆水解液对产丁醇梭菌影响的深入研究发现,玉米秸秆水解液可以抑制梭菌生长及其对糖的利用,显著改变发酵产物比例,研究表明这种抑制作用可以在一定程度上通过氢氧化钙碱预处理去除,Zhang等[23]利用Ca(OH)2预处理玉米秸秆,再经纤维素酶法水解,可去除木质纤维素酶解抑制剂,是提高木质纤维素酶消化率的一种有效方法,同时玉米秸秆也被证实是生产丁醇的良好的原料。纤维素是化学纸浆生产的主要原料,而木质素、半纤维素和外酯3种成分可以被认为是纸浆工业的副产品,原料在燃烧过程中,半纤维素是许多工厂未充分利用的可再生资源,所以提取黑液中的半纤维素,并将其用于生物化学转化为燃料和化学品是一个充满吸引力的商业发展方向。Kudahettige-Nilsson等[24]以二氧化碳酸化法回收硬木牛皮纸黑液中的酸水解木聚糖为唯一碳源,采用活性炭对水解产物进行解毒,研究ABE发酵, 论证了利用工业牛皮纸制浆黑液作为原料生产生物燃料(如丁醇)的可行性。。
 
木质纤维素生物质是地球上生物燃料生产中最丰富的可再生资源,作为一种非食品廉价原料,使得利用纤维素原料进行丁醇发酵成为可能,且具有很大的潜力[25]。但是,针对某些原料木质素含量高、预处理复杂、酶解糖化成本高以及戊糖发酵转化效率低等问题,仍需要做近一步探究,以解决相关关键技术问题。
 
2 过程工程代谢调控
利用外源添加的宏观调控策略,简单有效的改变体系组成与浓度水平,进而调控细胞水平上的生理代谢活动,如胞内碳流代谢、氧化还原平衡及NAD(P)H水平、细胞毒性胁迫效应,以及应激蛋白和关键酶表达水平等。
 
2.1 碳流代谢
早期研究发现外源添加乙酸或丁酸,能够抑制丙酮丁醇梭菌产酸代谢,诱导丙酮丁醇代谢[26-27]。Hüsemann等[28]向培养基中添加30 mmol/L乙酸,发现丙酮丁醇梭菌产溶剂阶段并未提前,但发酵终点的丁醇产量提高至37 mmol/L。Cho等[29]针对丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌对不同浓度乙酸外源添加条件下发酵性能的比较,研究结果显示,丙酮丁醇梭菌在3.7-9.7 g/L乙酸浓度下,随浓度升高ABE发酵能力呈上升趋势,当乙酸浓度超过11.7 g/L,其溶剂代谢则受到抑制作用;相反,拜氏梭菌对于不同乙酸添加条件,其溶剂生产水平无明显变化。
 
添加苄基紫精、甲基紫精及甲基蓝等人工电子载体的外源调控策略,能够抑制产氢代谢,增加还原力NAD(P)H水平,有利于溶剂生产代谢[30]。早在1986年,Jones等[31]研究了苄基紫精在丙酮丁醇梭菌连续发酵过程中的调控作用发现,其能够改变碳流代谢方向,使发酵过程迅速进入产溶剂阶段。此外,关于甲基紫精提高依赖NADH的醇醛脱氢酶活性以及提高溶剂产量的研究数量也在逐渐增加。
 
2.2 氧化还原水平及毒性胁迫效应
Ujor等[30]分别在2014年和2015年研究发现,培养基中外源添加甘油和别嘌呤醇能够在高浓度糠醛胁迫条件下,促进菌体生产以及糠醛脱毒效率,同时提高溶剂代谢。但是二者的区别在于,甘油的存在可显著提高NADH水平,利于溶剂生成,同时NAD(P)H可以将有高毒性的糠醇类物质转化为低毒性,降低毒性胁迫;而别嘌呤则是通过调控机制降低糠醛对DNA的损伤,来缓解毒性胁迫对菌体产溶剂期转变造成的不良影响[32-34]。Sabra等[35]研究了外源添加甘油对纤维素发酵生产丁醇的影响,发现甘油增强溶剂丁醇产量2.6倍,这为木质纤维素原料发酵生产丁醇所遇到的毒性抑制物制约因素提供了研究方向。有研究表明,木质纤维素原料经降解生成的呋喃类化合物糠醛在0.5-2.0 g/L浓度范围内时,对ABE发酵有正向调控作用,相反,当糠醛浓度超过2.0 g/L,则会对发酵产生强烈抑制作用[36]。
 
2.3 应激蛋白及关键酶表达
Han等[37]研究了钙离子对丁醇发酵的调控作用,在拜氏梭菌NCIMB8052发酵培养基中外源添加0.5 g/L碳酸钙或氯化钙,可分别提高ABE发酵产量至15 g/L或17 g/L,Han研究团队进一步对该菌进行了蛋白质组学研究发现,在碳酸钙调控作用下,拜氏梭菌NCIMB8052胞内与碳源转运或代谢关键酶以及其他关键功能蛋白表达水平有显著提高,与原核细胞信号转导相关机制还有待进一步研究。
 
此外,镁离子、锰离子和锌离子,二价铁离子在调控代谢关键酶活性方面也有重要的作用。乙酸代谢途径过程中,镁离子和锰离子具有调控乙酸激酶催化活性的功能[38-39],而二价铁离子和锌离子则是分别作为丙酮丁醇梭菌氢化酶和丁醇脱氢酶的关键辅因子,对ABE发酵进行潜在调控[40-41]。Wu等[42]研究了ABE发酵过程中,锌离子的添加对于有机酸等毒性代谢物耐受性的影响发现,在0.45 g/L甲酸存在下,相比对照组利用29.49 g/L葡萄糖产生5.27 g/L丁醇,有锌离子添加的实验组利用55.24 g/L葡萄糖产生11.28 g/L丁醇。更重要的是,锌离子的存在对于菌体耐受毒性代谢物有显著影响。
 
3 产丁醇梭菌遗传改造与代谢工程
对于低生产率、丁醇产物抑制等ABE发酵产物障碍仍需通过微生物育种的方式解决。微生物选育的手段有很多,包括定向育种、诱变育种、杂交育种、细胞融合和基因工程等育种技术,其目的就是要把生物合成代谢途径朝着目的方向引导,或者促使细胞内基因发生重新组合,从而优化遗传性状,定向地使某些代谢产物过量积累,获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。
 
在目前的条件下,昂贵的发酵底物,大量合成的副产品,以及产物正丁醇浓度较低(<15 g/L)等因素使传统丙酮丁醇梭菌的工业化发酵可行性不高。研究者们已经尝试通过微生物代谢工程去提高梭状芽孢杆菌产溶剂性能或是构建正丁醇生产菌株。利用基因工程手段修饰或者改造丁醇生产菌的一些代谢途径,达到提高丁醇产率,解除产物阻遏效应等目的。穿梭载体、转化和接合、转座诱变、报告基因、RNA干扰技术和DNA基因芯片等遗传工具及技术对于梭菌属代谢工程的成功至关重要,丙酮丁醇梭菌ATCC 824菌株及其突变体作为良好的基因改良对象,关于基因和代谢工程技术的内源改造已有较多应用研究[43]。
 
Spo0A是控制产孢的一种转录调节蛋白,它也同时调控丙酮、丁醇的产生,它对溶剂形成的影响是调节芽孢与溶剂基因表达的平衡作用:它的过度表达打破了孢子生成与溶剂产生的平衡关系,研究表明Spo0A过表达菌株824(pMSPOA)的丁醇产量更高[44]。Dürre[45]在研究中也提出了其他的调控因子。AdcR和AdcS是新的转录因子和调控因子[46],CodY和CcpA是革兰氏阳性细菌中的多效调控蛋白[47]。丙酮丁醇梭菌ATCC824的最佳基因修饰之一是表达醇/醛脱氢酶基因aad(也称adhE1)的solR敲除突变体[48]。Harris等[49]研究结果表明,solR在调节溶剂形成过程中起着重要的作用。通过发酵表征和代谢通量分析发现,solR失活丙酮丁醇梭菌菌株(SolRH)具有较高的葡萄糖利用率,与野生型相比,该菌株产生较高浓度的溶剂;SolRH(pTAAD)菌株在失活solR的基础上带有一个含用于丁醇生产的aad拷贝基因的编码质粒,这使得其丁醇产率达到17.6 g/L。采用基因失活和基因过表达两种代谢工程方法,是研究某些特殊基因修饰对梭状芽胞杆菌发酵特性影响的有效方式。在敲除丁酸激酶基因(buk)菌株的发酵液中,丁醇的产量可达16.7 g/L[50]。代谢工程菌增加丁醇产量的直接策略通常是使得除丁醇外生产其他溶剂的的基因失活。Kuit等[51]通过中断丙酮丁醇梭菌内的乙酸激酶基因(ack),导致其乙酸生产量降低80%,而丁醇、乙醇等其他溶剂产量均有所增加(16%)。参与蔗糖分解代谢的3个重要基因(scrA、scrB和scrK),以及一个醛/醇脱氢酶基因(adhE1),Zhang等[52]从丙酮丁醇梭菌菌体中克隆相关基因并引入到已敲除乙酸激酶基因(ack)的酪丁酸梭菌中,在进行重组菌发酵实验时发现,本来不能利用蔗糖的酪丁酸梭菌可利用甘蔗汁产生14.8-18.8 g/L丁醇。
 
梭菌的靶向基因敲除工具主要是通过ClosTron方法实现。该法主要是由Heap等[53]首创并改进得到的一种可靠的针对梭菌属基因敲除技术,ClosTron质粒可提供蓝白筛选和其他鉴定重组质粒的选择方法,改进后的ClosTron系统取代了原型质粒pMTL007和原始方法,更充分地利用了Ⅱ类内含子的潜力。2012年,Heap团队公开发表了一种基于等位基因交叉互换将大DNA片段整合到梭菌染色体上的新方法,此项研究为DNA的可靠整合开辟了新道路,包括多种微生物的大型合成结构[54]。删除策略和诱导启动子系统也是在不断开发的技术[45]。通过代谢工程改造丁酸梭菌25755,让其超表达醛/醇脱氢酶2(adhE2)在原生硫代酶启动子(thl)控制下,将丁酰基辅酶A转化为丁醇[55]。为满足工业生产生物燃料乙醇/异丙醇/丁醇组成的混合物,有研究建立不同的合成异丙醇操纵子通过穿梭质粒引入丙酮丁醇梭菌ATCC824,构建代谢工程菌进行工业生产[56]。Bankar等[57]利用基因手段研究开发出一种DSM 792型菌株,通过使用等位基因-偶联交换,将拜式梭菌NRRLB593的第二乙醇脱氢酶引入丙酮丁醇梭菌内,从而达到丙酮转化为异丙醇的目的,提高异丙醇的产量。
 
此外,还有一些经典实例,如在不影响溶剂的情况下,阻断孢子形成过程[58],通过单一点突变的方式,增加菌体耐氧性[59]。为了增加丙酮丁醇梭菌对丁醇耐受性,Tomas等[60]通过在菌体中过量表达分子伴侣GroESL蛋白,增强了重组菌对丁醇的耐受性,同时丁醇的产量也提高到17 g/L。
 
目前对于产丁醇工程菌构建的研究主要集中在利用关键基因过表达和基因敲除技术对丙酮丁醇梭菌进行遗传改造。但是,考虑到梭菌的分子技术操作复杂,难度较大,且目前所得重组菌并未达到工业要求产量,因此,遗传改造技术及菌体内部分子机理仍需进一步研究。
 
4 展望
近年来,生物丁醇作为一种生物燃料,针对能源、环境、经济发展的现实要求,它的生产及研究开发已经引起了越来越多的关注。生物丁醇的多项性能优于第一代生物燃料,前景广阔,虽然发酵法生产丁醇在环保和节约能源方面有许多优势,但它同时也存在一些问题,制约着它的发展。为满足大批量工业化生产,根据近年生物丁醇研究的国内外进展情况和存在的问题,可以从以下几个方面加强研究。(1)尝试利用廉价原料,以甜高粱、木质纤维素等廉价非粮食作物为原料,利用低成本发酵原料在最大程度上提高产物丁醇的产率,实现廉价生物材料工业转化的同时,经济环保生产生物丁醇从根本上解决温室气体排放,缓解全球能源危机。(2)通过研究丁醇合成代谢途径,得知或预知产物生物合成过程,以宏观代谢调控的方式增加限速步骤的代谢通量,然后改变培养环境增加流向产物合成的代谢流,从而使产物的产率大幅度提高,同时减少分叉代谢途径的代谢通量即可以提高目标代谢途径的碳流量。(3)随着分子生物学以及相关技术手段的不断发展,利用基因工程手段对微生物进行遗传改造,定向地改变或优化生物体遗传性状,为工业化生产提供优良高产菌种。对产丁醇生产菌而言,提高菌种的丁醇耐受性以及强化与丁醇合成紧密相关的关键酶基因的表达,以期提高菌种的丁醇耐受性